三光子显微镜能对深部皮层下脑区进行神经元群体成像吗？

深部成像与大视场为何相互制约

双光子显微镜是在体钙成像的常用工具，但随着深度增加，激发光散射和焦外信号累积会损害图像质量。论文指出，正因如此，皮层下区域此前主要只能通过侵入性方法到达；在大鼠中，透过完整组织的双光子成像通常局限于浅层皮层。

三光子（3P）显微镜使用更长的激发波长来减少散射，并且因为信号取决于脉冲能量的三次方，它改善了光学切片能力。同一种非线性也带来了论文要解决的问题：信号 S 随焦斑直径 d 按 1/d² 衰减，而每行焦斑数 N 增加时按 1/N⁶ 衰减。作者计算，扩大视场的两种常用方法在 2 mm 视场直径下会使 3P 信号下降 2.5 至 4.5 个数量级。

另一个限制是组织加热，它限制了激发功率；而维持高脉冲能量所需的低重复频率，又限制了在钙成像帧率下能采样多少焦斑。论文报告，此前约 1 mm 深度的 3P 工作覆盖面积不超过 0.3 mm²，单平面群体约 100 个细胞。

稀疏采样保住信号而非丢弃信号

LIFT 的设计选择是：在不漏采细胞的前提下尽可能稀疏地采样焦平面，并以仍能分辨钙事件的最低帧率记录。作者没有假设采样密度的影响，而是实际测量了不同焦斑间距下的细胞分割保真度，以及不同帧率下的钙事件提取保真度。

他们选定 4 µm 焦斑间距和 6 Hz 帧率，这一组合使分割和事件提取的保真度都保持在 0.9 或以上，同时实现最大稀疏度。加大焦斑间距还减少局部组织加热，从而允许在脑表面使用更高功率，进一步提高信噪比（SNR）。论文认为，由于 3P 信号高度非线性，这种采样优化能在任意视场大小下，为功率受限系统最大化 SNR。

振镜中继使扫描速度与角度翻倍

该采样方案要求扫描器能快速扫过大角度，同时保持扫描速度和视场大小可调。作者指出，四种常用扫描器——振镜、共振扫描器、多面镜扫描器或 MEMS 反射镜——都无法做到这一点，因此他们自制了一个模块，把两个振镜按 1:1 中继配置，使扫描角相加。这使单个振镜的扫描速度翻倍。

他们还在扫描的折返段采集数据，即反射镜换向时偏离线性的那段运动。论文报告，在折返段成像使给定帧率下的视场增大 2.4 倍。借助优化采样，LIFT 能以 4.7 Hz 对 2 mm 直径视场成像，或以 27 Hz 对 1.65 mm × 0.45 mm 视场成像，并能在比传统 3P 系统大 2 至 5 倍的视场上提供低于 0.5 µm 的横向采样。

显微镜完全由现成组件组装，作者将此作为可复现性的选择。一个后果出现在限制中：56% 的功率损失在物镜上，因为该物镜是为 1100 nm 及以下波长设计的。

去噪把微弱信号变成可计数的细胞

这一尺度的原始 3P 钙成像电影噪声很大，因此作者应用了 DeepCAD-RT——一种自监督深度学习去噪器，先在每个数据集上训练模型，再去噪该数据集。他们将其与高性能滤波方法比较，报告它显著提高了 SNR 和活动可分辨的神经元数量，同时保留了荧光轨迹。

这一步对理解标题中的细胞数很重要。所报告的群体是去噪、用 CNMF 分割并去除高相关成分之后活动可分辨的细胞，而不是体积中每个标记神经元的原始计数。论文报告，与人工标注的真值以及降采样到 4 µm 采样的高分辨率数据相比，分割 F 分数为 0.9。

三个相邻脑区中逾 1500 个细胞

在水平圆盘跑步机上奔跑的清醒头部固定小鼠中，LIFT 以 4 µm 横向采样和 6 Hz 记录钙活动。作者识别出 1540 个活跃细胞，跨越 CA1、相邻胼胝体和皮层，并将其轮廓叠加在最大强度投影上。多数轨迹的 SNR 在 3 到 8 之间，论文显示即使最低 SNR 组也有明显瞬变。

同一数据集还把活动与行为联系起来：在小鼠运动皮层 1 mm 深度，86 个细胞的亚群在运动时段活动升高（双侧 Wilcoxon 符号秩检验，P = 3 × 10⁻¹⁵）。另外，覆盖 CA1 中 0.73 mm² 的 27 Hz 数据集从 400 个活跃细胞获得高 SNR 轨迹，0.8 至 2 µm 横向采样的数据集也显示高 SNR，作者以此作为跨尺度和帧率灵活性的证据。

大鼠皮层标出深度极限所在

在表达胞体靶向指示剂 Ribo-jGCaMP8m 的大鼠中，LIFT 以 1 µm 横向采样、不做后处理地对次级运动皮层成像。分割到的细胞数在 700 至 1400 之间，取决于成像深度相对于细胞层的位置。在最大深度 1200 µm 处，可见 900 多个细胞，多数 SNR 在 4 到 14 之间。

这是论文中最深的演示，也是麻醉大鼠中的结构和群体层面结果，而非行为记录。作者指出，大鼠成像深度受光学植入物上方 Metabond 层厚度的限制，该层使物镜到脑的距离无法小于 1.25 mm。论文还说明，这些实验是初步示例用例，未随机化也未设盲，且未用统计方法确定样本量。

功率预算决定下一步能走多远

论文对 LIFT 限制的说明很具体：成像深度和 SNR 受物镜后功率约束，作者预计随着为 1300 nm 光设计的现成物镜上市，这一限制将缓解。由于优化采样放松了组织加热约束，更高的物镜后功率可在保持脉冲能量的同时提高重复频率，从而每帧采集更多数据点，并把视场扩展到本工作展示之外。

实际解读是一种权衡，而非固定规格。焦斑间距、视场和帧率通过给定深度下的最佳重复频率相互耦合，因此更精细的采样要以缩小视场或降低帧率为代价。对判断 LIFT 是否适合某个问题的使用者来说，已展示的包络就是相关阈值：小鼠约 1 mm 深度、跨相邻脑区逾 1500 个细胞；大鼠皮层 1.2 mm 深度、逾 900 个细胞；功能小鼠数据以 4 µm 采样、6 Hz 获得，并对活动电影应用了去噪。

本文引用的文献