靶向转录终止窗口的反义寡核苷酸能否抑制基因表达？

注释基因之外的靶向区域

多数反义寡核苷酸（ASO）设计瞄准成熟 mRNA 或基因体内的内含子。这项研究转而追问：ASO 能否结合 RNA 聚合酶 II 越过多聚腺苷酸化信号（PAS）后仍在合成的新生 RNA？PAS 是前体 mRNA 通常被切开并加上多聚腺苷酸尾的位点。PAS 之后的这段转录区域称为终止窗口；作者引用的人类细胞数据显示，终止窗口中位长度为 3.3 kb，有些可从注释基因末端延伸超过 10 kb。

作者把这类分子称为基因下游 ASO，即 DG-ASO。他们使用 16 个核苷酸的 gapmer ASO：中间是 10 个核苷酸的 DNA 缺口，两侧各带 3 或 4 个 LNA 修饰核苷酸，骨架为全硫代磷酸。DNA 缺口使 RNase H1 能够切割靶标；RNase H1 是一种识别 DNA:RNA 杂交体并切开其中 RNA 链的酶。主要实验中，DG-ASO 位于最远端 PAS 下游 0.5 kb 以内；针对 KPNB1 的一条 DG-ASO 放在两个主要近端 PAS 下游 2 至 2.5 kb 处，仍然有效。

mRNA 下降依赖 RNase H1 切割

RT-qPCR 检测显示，DG-ASO 使 CHMP1A 和 KPNB1 的 mRNA 明显下降；结果以 GAPDH 和阴性对照归一化。三条独立证据把这一下降与 RNase H1 切割联系起来，而不是仅仅归因于 ASO 占据 RNA。第一，用 siRNA 敲低 RNase H1 后，两种 mRNA 的水平都得到恢复。第二，过表达催化失活的 D210N RNase H1 突变体——它能结合 DNA:RNA 杂交体但不能切割——与过表达野生型 RNase H1 相比，抑制了所有受试 ASO 的敲低效率。第三，结合相同位点但不能招募 RNase H1 的 mixmer ASO 没有降低这两种 mRNA。

两个基因的恢复程度并不相同。作者指出，敲低 RNase H1 后 KPNB1 的变化较弱，他们将其归因于 siRNA 与基因体 ASO、DG-ASO 共转染效率不佳。这是证据中一个分支的技术限制，不影响 RNase H1 是必要条件这一总体结论，因为催化失活突变体和 mixmer 实验分别独立支持了这一点。

切割竞争过 3' 端加工机器

为了观察 3' 端发生了什么，作者设计了能区分成熟 mRNA 与 3' 延伸形式的 RT-PCR 引物。一条反向引物位于 PAS 上游，可同时扩增两种形式；另一条位于 PAS 下游、DG-ASO 结合位点之前，只扩增被 RNase H1 切割后产生的延伸形式。由于产物长 283 至 558 bp，不适合 qPCR，反应每两个循环终止一次，再用琼脂糖凝胶读取结果。

在 DG-ASO 处理的细胞中，PAS 上游的扩增产物减少，与稳态 mRNA 的下降一致；代表未切割 3' 延伸形式的产物则增加。PAS 下游与上游信号的比值，CHMP1A 从 0.37 变为 0.02，KPNB1 从 1 变为 0.08。作者将此解释为：RNase H1 在切割及多聚腺苷酸化因子（CPF）复合体于 PAS 处切割之前，先切开了 PAS 下游的新生 RNA，因此转录本始终没有得到正确的 3' 端。

错误转录本被加尾并送入外泌体

未加工的 3' 端不会只是停留在细胞核里。作者用 dTAG 系统敲低外泌体的催化亚基 DIS3，并通过蛋白质印迹和三个 PROMPT 的积累确认敲低成功。在 DIS3 被敲低的情况下，DG-ASO 处理后积累的 CHMP1A 和 KPNB1 3' 延伸转录本进一步增加，成熟 mRNA 水平也受到影响。

论文提出的模型是：加工错误的 pre-mRNA 仍会被加上多聚腺苷酸尾，但被识别为错误转录本，由外泌体降解。这对理解 mRNA 读数很重要：成熟 mRNA 的减少不只是转录本没被生产出来，而是一条从错误切割开始的降解路径最终显现的结果。

XRN2 在终止窗口获得更早入口

转录终止通常依赖 XRN2：这是一种 5' 到 3' 核酸外切酶，当 CPF 在 PAS 处切开 RNA 后，它加载到新产生的游离 RNA 末端，一边追赶减速的聚合酶，一边降解新生 RNA。若切割发生在终止窗口更靠前的位置，XRN2 就能提前起步。染色质相关 RNA 测序支持这一点：CHMP1A 和 KPNB1 的 5' 区域读取覆盖度未受影响，说明 DG-ASO 没有改变转录起始；而 ASO 结合位点下游的覆盖度下降。

功能验证使用跨越终止窗口的扩增片段，作为通读转录的替代指标。DG-ASO 降低了其结合位点下游的新生 RNA，而用 siRNA 敲低 XRN2 后，两个基因的这些水平都恢复到对照。单独敲低 XRN2 不改变 CHMP1A 或 KPNB1 的 mRNA 水平，作者据此认为 XRN2 不负责降解那些进入 mRNA 读数的 RNase H1 切割产物；它在这里的作用是加速清除下游新生 RNA。

新生 RNA 测量也为机制划定了边界。染色质相关 RNA 测序显示，DG-ASO 只中等程度改变这两个位点的新生 RNA（CHMP1A 的 log2 倍变化为 −0.8，KPNB1 为 −0.5；基因体 ASO 分别为 −1.5 和 −0.9）。作者由此判断，大部分降解发生在转录后，而不是在基因起始处阻断转录。

终止窗口也是脱靶风险来源

让 DG-ASO 有用的同一机制，也使在其他基因下游的非预期结合变得危险。作者测试了一条针对 HIF1A 设计的杂泛性 ASO（pASO）；它还与另外九种 mRNA 完全互补，并与 CHMP1A PAS 下游 236 个核苷酸处的一个位点存在不完美但有利的匹配，仅末端有一个错配核苷酸。在 THP1 细胞中，CHMP1A 终止窗口里的这个脱靶位点产生了与预期在靶效应相当的敲低。

他们随后追问，常见的化学修饰能否把两者分开。在 pASO 中央缺口的多个不同位置各加入一个 2'-O-甲基化，会改变对 CHMP1A 的脱靶效应，说明这类修饰的位置可以改变预期敲低与非预期敲低之间的平衡。实际要点在于：现行脱靶检查把 ASO 序列比对到包含成熟 mRNA、前体 mRNA 和非编码 RNA 的转录组数据库；终止窗口序列并未直接注释在其中，因此不会被筛查。

终止窗口的用处与证据边界

作者把终止窗口视为额外的设计空间。他们的例子是 ATF4：这个转录因子基因长 2.1 kb，在 HEK293 细胞中其终止窗口约 3.5 kb，纳入后可将可靶向序列扩展到 5.6 kb。他们还提出，DG-ASO 可能适合无内含子基因、针对单核苷酸变异的等位基因特异性敲低，以及基因体内难以杂交的高度结构化 RNA。

边界很具体。主要 DG-ASO 位于最远端 PAS 下游 0.5 kb 以内；虽然 KPNB1 的试剂在近端 PAS 下游 2 至 2.5 kb 处仍有效，作者预计有效距离需要按基因、细胞类型和生物体逐一确定，很可能取决于 poly(A) 信号的强度。研究在 HEK293、HeLa、SH-SY5Y 和 THP1 细胞中进行，使用转染 ASO，另有无载体摄取 5 µM 处理 7 天的实验；因此 20 nM 转染下看到的效力并不是临床给药结果。

因此，最影响判断的分界不是 DG-ASO 是否有效，而是一条给定序列落在收益还是风险一侧。候选 ASO 若与非靶基因的终止窗口匹配，就能像在靶试剂一样通过 RNase H1 沉默该基因；论文自己的 pASO 案例显示，这可以发生在一个仅有末端单错配的位点上。用终止窗口序列筛查设计候选，并检查 2'-O-甲基化位置如何改变在靶与脱靶的平衡，是这项研究提出的具体优先事项。

本文引用的文献