细胞数量不等于完整度
多数单细胞图谱用数据库中存储的细胞数量来表示自身规模。论文认为，这个计数回答不了编目项目真正关心的问题：组织里还有多少细胞类型没有被检测到。作者用一个具体例子说明差距：CELLxGENE 存储了 9610 万个细胞，而人体约有 36 万亿个细胞，按此计算完整度约为 0.0002%；但这些细胞来自不同器官且分布不均，作者指出这个数字并不适合衡量图谱完整度。
论文提出的替代做法是估计细胞丰富度，即一个组织中细胞类型（被视为细胞物种）的总数，再与已观察到的数量比较。由于细胞类型尚无统一定义，研究把细胞类别称为细胞物种，并依靠转录组谱的无监督聚类来确定被计数的单位。因此，完整度指当前数据已回收的细胞类型占估计丰富度的比例，而不是已测序细胞占全部细胞的比例。
生态学估计器为何适用于细胞图谱
物种丰富度估计器最初是为生态学面临的同一类实际问题而设计的：观察者永远无法看到栖息地中的每一个物种，因此观察到的物种数会低估真实总数。论文把这一逻辑迁移到单细胞数据上，构建“细胞物种×样本”矩阵，每个条目记录某个细胞物种是否在某个样本中被检测到。矩阵的稀疏结构，即哪些物种只出现在一个或少数几个样本中，正是估计器所利用的信息。
这种迁移之所以合理，是因为人体器官中的细胞丰度服从重尾分布。作者用对数正态、负二项、对数级数、帕累托和泊松模型拟合 Tabula Sapiens 中 20 个器官的细胞类型丰度，发现对数正态和负二项分布是观测数据的合理解释。他们还用 Split-seq 数据以及血液这种液体组织重现了重尾分布，以排除该模式是液滴测序技术假象的可能。
Chao2 最快逼近真实丰富度
由于细胞生态系统尚无公认的估计器，作者以一个已知真实丰富度的模拟人体为基准，比较了四种非参数估计器。模拟以 Tabula Sapiens 的参数为基础，按 20 个器官放大，并在从 10⁻² 到 10⁻⁸ 的覆盖水平上抽样。所有受测估计器在样本覆盖足够后都开始向真实丰富度稳定，即使是在含大量稀有物种的大器官中也是如此；使用三个以上样本还能进一步提高准确性。
其中，Chao2 最快趋于真实总体值，且不易高估。在误差分析中，与仅基于已观察细胞物种的估计相比，Chao2 的误差中位数降低了 12%。作者还用二项稀释提高单个样本的细胞丢失概率，检验其对细胞丢失的稳健性，发现这对物种发现或 Chao2 表现影响很小；他们认为原因是该估计器依赖所有样本间的稀疏结构，而非样本内的检测情况。
模拟还给出了一个实际预期：当样本覆盖整个细胞群体的 0.001% 或更多时，就能估计丰富度；所需测序投入强烈取决于器官复杂度，越复杂的器官需要越多采样。
真实图谱分析标记出不完整组织
随后，该框架被应用于真实数据。在 Emani 等人的人背外侧前额叶皮层数据集中，79,586 个细胞通过质量控制；作者估计这覆盖了该脑区约 69 亿个细胞中的约 0.0011%，高于模拟中对最复杂器官所要求的阈值。Chao2 在三个或更多样本时平均就能回收全数据集的丰富度，样本越多，置信区间越窄。
更细的二次抽样与重新聚类分析考察了每个样本需要测多深。对于七个高覆盖样本，当每个样本分析 3,000–4,000 个细胞时，物种回收率持续超过 95%，聚类一致性得分中位数高于 0.95；超过这一水平后，一致性和回收率的提升都很小。作者称这为实际饱和，并将其与 Chao2 预测结合，作为指导图谱级项目的策略。
当同一方法扩展到成体眼、发育中的眼和发育中的前额叶皮层等单核或单细胞数据集时，这些数据集都被标记为不完整，意味着进一步测序仍可能发现未见过的细胞物种。研究还评估了 Yao 等人规模庞大的小鼠等皮层数据集，其中超大样本已经捕获了完整的转录复杂性。
估计结果依赖哪些条件
作者指出，完整度估计不依赖具体的细胞类型定义，可以用任何单细胞技术结合无监督聚类来完成。这种灵活性也意味着结果依赖聚类质量。他们建议测试不同的聚类数量和分辨率，避免产生人为的小簇，因为这会引入虚假稀疏性并偏倚完整度估计；也不要在分析前通过高变基因选择等特征筛选限制数据集的变异性。由于方法依赖检测样本独有的细胞物种，每一个这样的观察都需要核实是真实事件还是聚类假象，批次校正后的数据整合质量也需要仔细评估。
作者还指出，Chao2 过去已被广泛用于聚类数据，并呼吁未来开发不依赖聚类的流形感知估计器。他们的模拟基于多元对数正态分布生成，但作为非参数估计器，即使潜在总体偏离对数正态，Chao2 预计仍能表现良好。
停止点应如何指导测序
论文的实践建议是把丰富度估计当作停止点：到了这个点，继续测序不再揭示新的细胞簇，项目便能以更低的成本完成。支持这一点的证据因组织而异。在模拟器官中，三个或更多样本就足以让估计器稳定；在前额叶皮层数据中，Chao2 平均用三个样本就能回收全数据集丰富度，样本增加后区间收窄。二次抽样分析还为所研究的高覆盖样本补充了每个样本约 3,000–4,000 个细胞的深度基准。
作者建议对每个已测器官定期运行丰富度估计，并主张未来应转向用多种互补技术（如单细胞、单核和空间方法）测序组织，因为这些技术能记录不同且常常互斥的细胞类型。因此，论文设定的优先事项不是简单地测更多细胞，而是把每个器官的估计丰富度与已观察到的数量对照，把剩余投入导向差距最大的地方。
本文引用的文献
Estimating the completeness of large-scale single-cell sequencing projects
把细胞类型视为物种，并对“细胞物种×样本”矩阵应用 Chao2 丰富度估计器，可以估算还有多少细胞类型未被检测到；该方法把多数已测组织标记为不完整，并为测序项目提供停止点。