Tim17 的选择性过滤器如何介导线粒体蛋白分选？

分选决定发生在 Tim17 入口处

大多数线粒体蛋白在胞质核糖体上合成，随后必须被送往基质或内膜。TIM23 复合体同时负责这两个去向，而 Tim17 构成前体蛋白滑过或插入的蛋白—脂质侧向界面。此前缺少的是一个机制，用来解释复合体如何读取前体蛋白的拓扑信号，并把它确定地导向其中一种命运。

论文给出的答案是结构性和静电性的。Tim17 朝向膜间隙一侧表面的带电残基，尤其是第 4 位和第 8 位的最初两个负电荷，充当选择性过滤器。作者提出，这些电荷与内膜蛋白跨膜结构域之后带负电的停转信号相互作用并相互排斥，从而减慢易位，让前体蛋白有时间侧向进入脂双层。

荧光报告器把停转变成可测信号

检验这一想法需要一种能在数千个酵母突变体中运行的检测方法，而用放射性标记前体进行的经典体外导入实验难以支持这种规模。作者构建了 FLASH，即用于高通量分析插入的荧光停转传感器。它把线粒体前序列、mCherry、一个淬灭结构域和 TEV 蛋白酶切割位点融合到一段短的 C 端序列上。

淬灭结构域是一条疏水螺旋，在水性环境中会四聚化并阻止 mCherry 成熟。当蛋白插入内膜时，淬灭结构域埋入脂双层，荧光随之出现。当蛋白被完整导入基质时，淬灭结构域留在水性环境中，荧光被淬灭。作者比较了两个版本：一个以 Dld1 来源的 RETKED 停转序列结尾的停转报告器，以及一个携带非停转 RR 序列的转运报告器。停转报告器给出强信号，转运报告器没有信号，而靶向基质的 TEV 蛋白酶使两者的荧光都恢复，这证实该读数反映的是膜插入，而不是导入失败。

全基因组耗竭筛选发现 Dmo2

作者把 FLASH 报告器整合进一株酵母，再与一个包含 5110 个系统性 AID-GFP 插入的文库杂交；在该文库中，蛋白被融合上生长素诱导降解子，加入 5-苯基生长素即可将其耗竭。荧光降低的细胞被挑出作为候选。由于许多命中反映的是报告器自身合成所需蛋白被耗竭，作者用 TEV 表达来区分一般性导入缺陷和特异性分选缺陷。

Dmo2 当时是一种尚未被表征的线粒体蛋白，它与 Tim23 一起出现在这次筛选中。在 DMO2 缺失突变体中，停转报告器只显示低荧光，而转运报告器不受影响，靶向基质的 TEV 则把荧光恢复到野生型水平。用分离线粒体进行的体外导入实验支持同一结论：在野生型线粒体中，内膜蛋白细胞色素 b2 到达蛋白酶无法接触的位置，而在缺少 Dmo2 时这一过程受到严重损害。在 37 摄氏度下对每种条件四个生物学重复进行的质谱分析显示，突变体的内膜蛋白显著减少，这与分选缺陷而非一般性导入缺陷相符。

Dmo2 构建二硫键以固定过滤器

筛选找到的是一个因子，而不是机制。共免疫沉淀显示 Dmo2 与 Tim17 相互作用，而与 Tim22 的相互作用更为短暂。相关的修饰最终被确定为 Tim17 中的一个二硫键：当第 10 位和第 77 位的半胱氨酸被替换为丙氨酸时，停转报告器的荧光强烈降低，重现了 DMO2 缺失的表型。该突变型 Tim17 的水平与野生型相当，并且仍能与 Tim23 形成复合体，因此这一效应不能用蛋白丢失或复合体组装失败来解释。

作者把 Dmo2 解释为引入这个二硫键的氧化酶，并把该键解释为连接 Tim17 N 端与其膜间隙环的结构夹。这个夹使过滤器的负电荷保持在位。该二硫键在较高温度下尤其重要，作者将其解读为共价连接提高了 Tim17 热稳定性的证据。

模拟把停转信号置于腔内

作者对结合底物的 TIM23 复合体进行全原子分子动力学模拟，以追问二硫键为何对分选重要。模拟以 Dld1 为底物，比较有二硫键和无二硫键的系统，并在膜两侧施加约 150 毫伏的膜电位。按作者的解读，该二硫键把 Tim17 带负电的 N 端定位在膜间隙表面，这些电荷在那里与带电荷的停转信号相互作用并排斥它，从而减慢前体蛋白。

在没有二硫键，或第 4 位和第 8 位的负电荷被突变时，模拟显示前体蛋白没有被正确停转，而是位置过深地停留在 Tim17 开放的入口腔内，这会使它们错误地进入基质。这些模型建立在已发表的 TIM23 结构和模拟之上，并非对每一类前体蛋白的直接结构观察，作者也将其描述为简化的工作模型。

电荷规则适用于许多前体但尚未普适

论文的机制主张建立在一个可识别的序列特征上：内膜蛋白普遍在跨膜结构域之后携带成簇的负电荷残基，Dld1 的 RETKED 序列就是这样一个停转信号。正是这一模式使基于电荷的过滤器有可能成为普遍的分选元件，而不是 Dld1 特有的现象。

作者明确指出普适性仍无定论。他们的模拟聚焦于 Dld1 模型底物，基于电荷的停转机制是否适用于多种膜前体，被列为未来实验和计算工作的问题。过滤器也被描述为线粒体内膜易位酶的保守元件，相关的 Tim22 亚基在可比位置携带二硫键和带电残基，作者将其作为提示提出，而非已证实的共享机制。

过滤器连接起三个独立观察

这项研究的价值在于它把三个原本彼此独立的观察联系起来：Tim17 上一簇保守的电荷、一种此前功能不明的氧化还原酶，以及停转序列如何中止易位这一长期未解的问题。二硫键不只是稳定性特征；在作者的模型中，正是它让电荷处在正确位置，从而区分不同前体蛋白。

这改变了寻找分选缺陷时的关注点。一个未能插入的前体蛋白并不一定导入失败；它可能被导入得过深。FLASH 的设计恰好使这一区分可测，因为膜插入丧失会导致荧光丧失，而 TEV 释放则使荧光恢复。对评估这篇论文的读者而言，决定性证据是 DMO2 缺失、Tim17 半胱氨酸突变以及第 4 位和第 8 位电荷突变汇聚到同一停转表型，而模拟提供的是位置解释，而非独立证明。论文自己提出的后续优先事项是 Dmo2 的底物谱，以及基于电荷的过滤器是否适用于全部内膜前体蛋白。

本文引用的文献