PyRMD2Dock：AI 助力解锁 4800 万分子库，精准打击“不可成药”CD28 靶点

TL;DR

针对蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）界面的小分子开发一直是药物研发的“深水区”。近日，研究人员利用 PyRMD2Dock 平台，展示了如何通过 AI 增强的虚拟筛选（VS）流程，从近 5000 万 个化合物中精准识别出能阻断免疫受体 CD28 信号的高亲和力小分子。这项工作不仅在方法论上实现了 3.3 倍的筛选加速，更在现实世界中发现了亚微摩尔级的先导化合物。

1. 免疫检查点的“浅平”挑战

CD28 是 T 细胞共刺激的关键受体，在免疫治疗中具有核心地位。然而，CD28 的结合界面（如 MYPPPY 基序）就像一片平坦且溶剂暴露的荒原，缺乏能让小分子“落脚”的深层药效口袋（Pocket）。

传统的基于结构的虚拟筛选（SBVS）面临两个死结：

• 效率瓶颈：面对亿级规模的 Enamine REAL 库，逐个分子的对接计算成本高得离谱。
• 靶点复杂性：PPI 界面缺乏典型特征，模型容易产生大量假阳性噪声。

2. Methodology：PyRMD2Dock 的双引擎策略

为了突破限制，作者采用了 机器学习（ML）分类器 + GPU 加速对接 的混合流程：

2.1 训练与优化

研究者首先从 Enamine REAL Diversity Set 中提取 240 万个分子作为训练集。

• 双重分类：根据 AutoDock-GPU 的对接评分（$\Delta G_{AD4}$），设立了多个活性阈值（如 -7.75 kcal/mol）和非活性阈值。
• 多模型并行：测试了 672 个不同的模型参数组合。利用 Butina 聚类 和层化 K 折交叉验证防止数据泄露。

2.2 流程架构

图 1：PyRMD2Dock 虚拟筛选工作流，结合了配体基础（LBVS）和结构基础（SBVS）的优势。

3. 实验发现：从 4800 万到亚微摩尔级先导物

经过 PyRMD 筛选，约 2000 万分子被预测为潜在活性物质。作者通过设置更严苛的相互作用约束（必须与 K109 和 C94 形成接触）以及溶剂可及表面积（SASA）分析，最终锁定了 232 个候选物，并购买了其中 150 个进行测试。

3.1 关键战绩

• Dianthus 筛选：初步鉴定出 12 个命中物（Hit Rate 7.3%）。
• MST 验证：化合物 100 和 104 展现了极强的亲和力，Kd 分别为 343.8 nM 和 407.1 nM。
• 通路阻断：在 CD28–CD80 竞争 ELISA 中，化合物 100 的 IC50 达到 231.4 nM，表现极其亮眼。

图 2：通过微scale热泳动（MST）技术验证的化合物浓度响应曲线。

4. 深度洞察：为什么 AI 能在噪声中生效？

传统的对接数据通常充满噪声。作者通过 t-SNE 可视化 发现，虽然初始对接结果在化学空间分布散乱，但 PyRMD 算法通过实施 Marchenko-Pastur 分布，有效地“去噪”并提取了具有相似化学特征的化合物簇（Clusters）。

有趣的是，化合物 100 和 104 虽然结构相似，但它们能以两种“互补且同等有效”的取向占据 CD28 的侧向裂隙。

图 3：三种不同的结合取向分析，展示了候选分子如何填补 CD28 界面旁的凹槽。

5. 生物学验证：走向临床前的 3D 系统

为了验证真实药效，研究不仅停留在分子水平，还进行了：

1. Jurkat 控制细胞实验：证实了细胞内信号转导的抑制。
2. 肿瘤-PBMC 3D 共培养模型：在模拟肿瘤微环境中，化合物显著抑制了 IFN-γ 的释放。
3. 人类气道粘膜模型：100 号化合物在复杂的上皮环境中依然有效，展示了良好的组织渗透力与稳定性。

6. 总结与展望

核心价值 (Takeaway)：该研究成功验证了 PyRMD2Dock 作为一种高可扩展工具，能有效挖掘海量化学库。通过 AI 辅助的结构筛选，我们不仅能发现新颖的化学主干（Chemotypes），更能解决像 CD28 这样 PPI 界面缺乏结合口袋的顽疾。

局限性：尽管筛选效率提升显著，但后期仍需繁复的人工目视检查与 SASA 过滤来排除对接评分的固有误差。未来，端到端的深度学习评分函数或许能进一步减少对手工过滤的依赖。

关键词：CD28, PyRMD2Dock, 虚拟筛选, 免疫检查点, PPI 小分子抑制剂